'PCR' යනු මේ දිනවල අපට නිතර ඇසෙන ඉතාම ජනප්‍රිය වචනයක්. මෙය කොරෝනා වයිරසය ආසාදනය වූ රෝගීන් හදුනා ගැනීම සදහා භාවිතා කරන පරික්ෂණයක් බව සෑම කෙනාම පාහේ දැන සිටියත් මෙම පරික්ෂණය සදහා ඔබගේ නාසයෙන් සාම්පල රැගෙන ගිය පසු ඒවාට සිදු වන්නේ කුමක්දැයි දන්නේ ඉතාමත් සුළු පිරිසක් පමණී. මේ ලිපියෙන් කතා කරමු ඒ ගැන.
පොඩි උදාහරණයක් එක්ක කතාවට බහිමු. මෙහෙම හිතන්න. ඔයා ගාව තියනවා කිලෝ පහේ හාල් උරයක්. ඔයාගේ යාලුවෙක් මේ හාල් උරේ ඇතුලේ රුපියලේ කාසියක් හංගලා ඔයාට කියනවා ඒක හොයන්න කියලා. වැඩේ ටිකක් අමාරුයි නේද? කාසිය පොඩි නිසාත් හාල් ප්‍රමාණය වැඩි නිසාත් කාසිය හොයාගන්න ටිකක් මහන්සි වෙන්න වෙනවා. නමුත් මෙහෙම හිතන්න. ඔයාගේ යාලුවා එක කාසියක් වෙනුවට කාසි 10ක් විතර අර කිලෝ පහේ හාල් උරේ අස්සේ හංගලා ඔයාට හොයන්න කියනවා කියල. එතකොට අර කලින් අවස්ථාවට වැඩිය කාසියක් ඉක්මණින් හමුවීමේ සම්භාවිතාවය වැඩි නේද?
ඉතින් 'PCR' එහෙමත් නැත්නම් 'Polymerase Chain Reaction' එකක සිද්ද වෙන්නෙත් උඩ උදාහරණයෙන් විස්තර වුන වැඩේට සමාන වැඩක්. වර්ෂ 1983 Kary Banks Mullis නැමති ඇමරිකානු විද්‍යාඥයා විසින් ලොවට හදුන්වා දුන් මෙම තාක්ෂණය 'molecular photocopying' ලෙසද හදුන්වනු ලබනවා. ඉහත උදාහරණයේ සගවනු ලැබූ කාසි ප්‍රමාණය වැඩි වන තරමට ඒවා සොයාගැනීමේ හැකියාව වැඩි වුනා වගේ PCR එකකදී යම්කිසි DNA සාම්පල් එකක් (උදා. වෛරසයක කුඩා කොටසක්) හදුනාගැනීමේ පහසුව සදහා එහි බහු පිටපත් විශාල සංඛ්‍යවක් නිර්මාණය කිරීම සිදු වෙනවා. භාවිතා කරන අරමුණ අනුව සහ සිදු කරන ආකාරය අනුව PCR පරීක්ෂණයේ ප්‍රභේද විශාල ප්රමාණයක් තිබෙනවා. වර්තමාන ලෝකයේ කොරෝනා වයිරසය ආසාදනය වූ රෝගීන් හදුනා ගැනීම සදහා භාවිතා වන්නේ Reverse Transcription PCR එහෙමත් නැතිනම් RT-PCR නැමති ක්‍රමවේදයයි.
මේ ලිපිය කියවන බොහෝ දෙනෙකු ගැඹුරු තාක්ෂණික පසුබිමක් සහිත පුද්ගලයින් නොවන නිසා පුලුවන් තරම් සරළව මේ ලිපිය ලිවීමට මා උත්සහ කරනවා. නමුත් මුලින්ම මේ ලිපියේ අන්තර්ගතය අවබෝධ කර ගැනීමට අවශ්‍ය වෙන ඉතාමත් සරළ තාක්ෂණික කරුණු කිහිපයක් පිලිබදව ඔබ දැනගෙන සිටිය යුතු වෙනවා.
මූලික කරුණු සරළව දැන ගනිමු.
අප පෘතුවියේ සිටින සෑම ජීවියෙකුගේම මූලික තැනුම් ඒකකය වන්නේ සෛලයයි. මෙම සෛලයක මධ්‍යයේ සියලුම සෛලීය ක්‍රියාකාරකම් පාලනය කරනු ලබන "න්‍යශ්ටිය" නම් ව්‍යාහයක් පිහිටා තිබෙනවා. එම න්‍යෂ්ටිය තුළ ඔබගේ සිරුරේ පැවැත්මට අදාළ වන දත්ත ගබඩාවක් පවතිනවා. එම දත්ත ගබඩාව අපි න්‍යෂ්ටියක 'DNA' ලෙස හඳුන්වනු ලබනනවා. DNA අණු ද්විත්ව හෙලික්සාකාර (Double helix) හැඩයකින් යුක්ත වන අතර ද්විත්ව හෙලික්සාකාර හැඩයක් යනු ඉණිමඟක් දක්ශිනාවර්තව ඇබරූ විට ලැබෙන හැඩයට සමාන හැඩයකී. මෙම DNA තුළ ජීවියෙකුගේ වර්ධනය, පැවැත්ම සහ ප්‍රජනනය සඳහා අවශ්‍ය දත්ත ගබඩා වෙනවා. මෙම දත්ත DNA තුළ ගබඩා කර තබා ඇත්තේ රසායනික සංඝටක 4ක් (නියුක්ලියෝටයිඩ - Nucleotide) යොදාගනිමිනී. එම රසායනික සංඝටක හතර ඇඩිනීන් (Adenine), ගුවනීන් (Guanine), තයමීන් (Thymine) සහ සෛටෝසීන් (Cytosine) වේ.
DNA අනුව තුළ මෙම රසායනික සංඝටක 04 පිහිටා ඇත්තේ යුගල ආකාරයෙනි. එනම් ඇඩිනීන් (Adenine) සෑම විටම තයමීන් (Thymine) සමගත්, ගුවනීන් (Guanine) සෑම විටම සෛටෝසීන් (Cytosine) සමගත් පිහිටයි.
නමුත් අපට හමුවන බොහෝමයක් වයිරස තුළ මෙම DNA වෙනුවට පිහිටා තිබෙන්නේ RNA නැමති ව්යුහයයි. උදාහරණයක් වශයෙන් වර්තමානයේ පවතින වසංගත තත්වය ඇති කරන SARS-CoV-2 වයිරසය, HIV වයිරසය ආදී වයිරස වල ඇත්තේ මෙම RNA නැමති ව්යුහයයි. මෙම RNA රසායනික වශයෙන් DNA වලට සමාන වුනත් ව්යුහයේ වෙනස්කම් පවතිනවා. DNA අණුවක හැඩය ඉණිමඟක් දක්ශිනාවර්තව ඇබරූ විට ලැබෙන හැඩය බව මා පැවසුවා ඔබට මතක ඇති. RNA අණුවක හැඩය ඉණිමඟක් රැගෙන එහි සිරස් අතට ඇති දඩු දෙකෙන් එකක් ඉවත් කර ඉතිරි වන කොටස දක්ශිනාවර්තව ඇබරූ විට ලැබෙන හැඩයට සමාන වෙනවා.
සෛල තුළ DNA පිහිටා ඇති ජීවීන් (සතුන්, ශාක, බැක්ටීරියා) ඔවුන්ගේ පැවැත්මට අවශ්‍ය කරන ප්‍රෝටීන නිපදවීමේදී පලමුවෙන් DNA අණු RNA අණු බවට පත් කොට අවශ්‍ය ප්‍රෝටීන නිපදවා ගනු ලබනවා. මෙසේ DNA අණු RNA අණු බවට පත් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය Transcription ලෙසද RNA අණු මගින් ප්‍රෝටීන නිපදවීමේ ක්‍රියාවලිය Translation ලෙසද හැදින්වෙනවා. වයිරසයක් ප්‍රෝටින නිපදවීමේදී Transcription ක්‍රියාවලියකින් තොරව Translation ක්‍රියාවලියෙන් කෙලින්ම ප්‍රෝටින නිපදවා ගනු ලබනවා. මන්ද ඔවුන්ට තිබෙන්නේ DNA අණු නොව RNA අණු නිසාවෙනි. මේ නිසාම වයිරසයක ප්‍රෝටීන නිපදවීමේ ක්‍රියාවලිය වේගවත්ව සිදු වේ.
PCR නොහොත් 'Polymerase Chain Reaction'
RT-PCR එකක් යනු කුමක්දැයි බැලීමට පෙර PCR එකක් යනු කුමක්දැයි හදුනාගෙන සිටිමු. ලිපිය ආරම්භයේ සදහන් කල ආකාරයට යම්කිසි DNA sample එකක් හදුනාගැනීමේ පහසුව සදහා එහි බහු පිටපත් විශාල සංඛ්‍යවක් නිර්මාණය කර ගැනීම PCR එකක් මගින් සිදු වෙනවා. Thermal Cycler, PCR Machine, DNA Amplifier යන නම් වලින් හදුන්වනු ලබන උපකරණයක මෙම PCR ක්‍රියාවලිය සිදු කරනු ලබනවා. PCR එකක් ප්‍රධාන වශයෙන් පියවරයන් තුනක් යටතේ සිදු කරනු ලබනවා. එහි පලමු පියවර වන්නේ "Denaturation" එහෙමත් නැතිනම් දුස්‌සභාවීකරණයයි. මෙහිදී සිදු වන්නේ කුමක්ද?
කලින් පැහැදිලි කල ආකාරයට DNA අණු නියුක්ලියෝටයිඩ වලින් නිර්මාණය වී තිබෙනවා. මෙසේ නියුක්ලියෝටයිඩ පිහිටා ඇති අනුක්‍රමය (sequence) දන්නා DNA අණුවක් අපි ලග තිබෙනවා යැයි හිතන්න. එම DNA අණුවේ එක් පැත්තක (DNA අණු ද්විත්ව හෙලික්සාකාරයි. ඉණිමගේ සිරස් අතර ඇති එක් දන්ඩක් සිහියට නගා ගන්න.) පිහිටා ඇති නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රමය 'A A T T G C' නම් ඊට විරුද්ධ පැත්තේ තිබිය යුත්තේ 'T T A A C G' යන නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රමයයි. මොකද ඉහත පැහැදිලි කල ආකාරයට Adenine (A) සෑම විටම Thymine (T) සමගත්, Guanine (G) සෑම විටම Cytosine (C) සමගත් පමණයි පිහිටන්නේ. Denaturation පියවර යටතේ දැන් මොකද කරන්නේ, නියුක්ලියෝටයිඩ පිහිටා ඇති අනුක්‍රමය දන්නා මෙම DNA එක අධික උෂ්ණත්වයකට භාජනය කරනු ලබනවා. සාමාන්යෙන් සෙල්සියස් අංශක 90 - 95 අතර උෂ්ණත්වයකට මෙම DNA අණුව භාජනය කරනු ලබනවා. එවිට DNA අණුවේ නියුක්ලියෝටයිඩ එකට බැදී ඇති හයිඩ්රජන් බන්ධන බිද වැටී DNA අණුව දෙකට කැඩී වෙන් වෙනවා. (ද්විත්ව දාමයක්‌ව පැවති DNA අණුව තනි දාම දෙකක් බවට පත් වෙනවා.) ඉණුමගක් අරගෙන තිරස් අතට හරි මැදින් කපා වෙන් කලාම වෙන දේ DNA අණුවට මේ අධික උෂ්ණත්වය නිසා සිදු වෙනවා. දැන් 'A A T T G C' කියන අනුක්‍රමය සහිත එක් තනි දාමයකුත්, 'T T A A C G' කියන අනුක්‍රමය සහිත තවත් තනි දාමයකුත් ලෙස තනි දාම 2ක් පරීක්ෂණ නළය තුළ පවතිනවා.
මීළගට දෙවන පියවර ලෙස annealing එහෙමත් නැති නම් ඉතා සෙමින් සිසිල් කිරීමේ ක්‍රියාවලිය ආරම්භ කරනු ලබනවා. මෙහිදී සිදු වන්නේ කුමක්ද?
මෙහිදී සිදු වන්නේ primers ලෙස හදුන්වන කෙටි නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රම කිහිපයකින් සමන්විත තනි දාම DNA කොටස් 2ක් පරීක්ෂණ නළය තුළට එකතු කිරීමයි. (සරළව කිව්වොත් primers යනු DNA සංශ්ලේෂණය ආරම්භ කිරීමට උපකාරී වන දෙයකී.) මෙසේ එකතු කිරීමෙන් පසුව primer එකෙහි ඇති කෙටි නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රමයන්ට අනුපූරක වන කොටසක් අපගේ කොටස් දෙකකට වෙන්වූ DNA අණුවෙහි එක් කොටසක හෝ ඇතන්ම් එම කොටස සමග අදාළ primer කොටස් සම්බන්ධ වීමට ඉඩ ලබා දෙනවා. මෙසේ සම්බන්ධ වීමට නම් පලමු පියවරේදී භාවිතා කල සෙල්සියස් අංශක 90-95 අතර උෂ්ණත්වය සෙල්සියස් අංශක 50-55 පමණ අඩු කල යුතු වෙනවා.
මීළගට තුන්වන පියවර ලෙස extension ක්‍රියාවලිය ආරම්භ කරනු ලබනවා. මෙහිදී සිදු වන්නේ කුමක්ද?
මෙම අවසාන පියවරේදී පරීක්ෂණ නළය තුළට DNA වල තැනුම් ඒකක වන නියුක්ලියෝටයිඩ (A,T,G,C) එකතු කරනු ලබනවා. දැන් අපගේ පලමු පියවරෙන් ද්විත්ව දාමයක්‌ව පැවති DNA අණුව තනි දාම දෙකක් බවට පත් වී දෙවන පියවරේදී එක් කල primers නිසා DNA අණුව සංශ්ලේෂණය වීම ආරම්භ වුනා. බන්ධන නොමැතිව තිබූ නියුක්ලියෝටයිඩ වලට තුන් වන පියවරේදී එක් කරන නියුක්ලියෝටයිඩ එක් වී සංශ්ලේෂණය ආරම්භ වූ DNA අණුව සංශ්ලේෂණය සම්පූර්ණ වී පරිපූර්ණ DNA අණුවක් නිර්මාණය වෙනවා. ඒ අනුව ආරම්භයේ පැවති එක් තනි DNA අණුවකින් අපි සාර්ථකව තවත් DNA අණුවක් පිටපත් කර ගනු ලැබුවා.
මේ ආකාරයටම මෙම පියවරයන් තුන නැවතත් අප ලබා ගත් DNA අණු දෙකට සිදු කලහොත් අවසානයේ අපට DNA අණු හතරක් ලබා ගැනීමට හැකි වෙනවා. මෙලෙස සිදු කරන PCR චක්‍ර (PCR Cycles) ගණනාවකින් පසුව (සාමාන්යෙන් වට 20–30) පරීක්ෂණ නළය තුළ සැලකිය යුතු DNA ප්රමාණයක් වර්ධනය වෙනවා. මෙලෙස පිටපත් බිලියනයක් පමණ ලබා ගැනීමට ගත වන්නේ පැය 2-3 ක් වැනි ඉතාම කෙටි කාලයක් පමණි.
PCR සහ RT-PCR අතර ඇති වෙනස කුමක්ද?
කලින් සදහන් කල ආකාරයට වයිරස තුළ තිබෙන්නේ DNA අණු නොව RNA අණුයි. එම නිසා වෛරසයක ඇති RNA අණුවක කුඩා කොටසක් ගෙන PCR එකක් සිදු කිරීමට හැකියාව නැහැ. මොකද PCR එකක් සිදු කිරීමට නම් සැම විටම DNA අණුවක් අවශ්‍ය වෙනව. මෙම හේතුව නිසා වයිරසයක ඇති RNA අණු පලමුවෙන් DNA අණු බවට පත් කර ගෙන ඉන් පසුව DNA බවට පත් වූ RNA එක සදහා PCR පරීක්ෂණය සිදු කල යුතු වෙනවා.
DNA අණුවක් RNA අණුවකට පත් කිරීම Transcription ලෙස හැදින්වෙන බව මා කලින් සදහන් කලා. දැන් සිදු වී තිබෙන්නේ මෙහි ප්‍රතිවිරුද්ධ ක්‍රියාව වන RNA අණුවක් DNA අණුවක් බවට පත් කිරීමයි. එම ක්‍රියාවලිය reverse transcription ලෙස හදුන්වනු ලබනවා. මෙසේ RNA අණු DNA අණු බවට පත් කිරීම reverse transcriptase නැමති එන්සයිමය මගින් සිදු කරනු ලබනවා. මෙසේ RNA අණුවක් DNA අණුවක් බවට පත් කලායින් පසුව සාමාන්‍ය පරිදි නැවතත් කලින් විස්තර කෙරූ පියවර තුනක් සහිත PCR ක්‍රියාවලිය සිදු කිරීමට හැකියාව ලැබෙනවා.
PCR ප්‍රතිඵලයක ඇති CT අගය යනු කුමක්ද?
යම්කිසි DNA හෝ RNA අණුවක් හදුනා ගැනීමට අවශ්‍ය මට්ටමට බහු පිටපත් නිපදවා ගැනීමට PCR පරීක්ෂණයක් කෙතරම් වාර ගණනක් (PCR Cycles) සිදු කලේද යන්න CT අගයෙන් දක්වනු ලබනවා. මෙහෙම හිතන්න සුනිල් සහ අමර ලෙස පුද්ගලයින් දෙදෙනැකු සිටිනවා. මේ දෙදෙනාම PCR පරීක්ෂණය සදහා යොමු වෙනවා. PCR ප්‍රතිඵලය පැමිණි විට සුනිල්ගේ CT අගය 20 ලෙසත්, අමරගේ CT අගය 36 ලෙසත් දැක්වෙනවා. මෙයින් අදහස් වන්නේ කුමක්ද? සුනිල්ගේ ශරීරයේ ඇති වයිරසයේ RNA අණු හදුනා ගැනීමට අවශ්‍ය මට්ටමට බහු පිටපත් නිපදවා ගැනීමට PCR චක්‍ර 20ක් සිදු කිරීමට සිදු වී ඇති බවත් අමරගේ සිදු කිරීමට අවශ්‍ය වී ඇත්තේ PCR චක්‍ර 36ක් පමණක් බවත් එයින් අදහස් වෙනවා. මෙතනින් බරපතල ලෙස වයිරස ආසාදනයක් සිදුව ඇතැයි ඔබ සිතන්නේ කාටද? සුනිල් නැමැත්තාගේ වාර 20ක් පමණක් සිදු කිරීමෙන් හදුනා ගත් වයිරස් ආසාදනය අමරගේ හදුනා ගැනීමට වාර 36ක් සිදු කිරීමට සිදු වී තිබෙනවා. ඒ කියන්නේ අමරට සාපේක්ෂව සුනිල්ගේ ශරීරය තුළ වැඩි ප්‍රමාණයක Viral RNA තිබී තිබෙනවා. සරල උදාහරණයක් ගනිමු. හිතන්න සුනිල් සහ අමරට වතුර කොප්ප දෙකක් ලබා දීලා කියනවා මේ වතුර කොප්ප දෙක පලවෙනියෙන්ම පුරවලා ඉවර කරන කෙනා දිනුම් කියලා. නමුත් තරගය පටන් ගන්න කලින් සුනිල්ගේ වතුර කොප්පය 2/4 (භාගයක්) පුරවලා තියෙන්නේ. අමරගේ කොප්පය 1/4 පුරවලා තියෙන්නෙ. දැන් අනිවායෙන්ම සුනිල්ගේ වතුර කොප්පය අමරගේ කොප්පය පිරෙන්න කලින් පිරෙනවා නේද? මොකද එයාට තරගය පටන් ගන්න කලින් ඉදලාම කොප්පයේ වතුර අමරට සාපේක්ෂව වැඩි ප්රමාණයක් තිබුන නිසා. මෙම CT අගය මගින් යම්කිසි පුද්ගලයෙකු වයිරසය නිසා බරපතල ලෙස ආසාදනය වී ඇද්ද නැද්ද යන්න පෙන්වා දුන්නත් එම ආසාදානය යම්කිසි පුද්ගලයෙකුට බලපාන්නේ කෙසේද යන්න පෙන්වා දෙන්නේ නැහැ. සමහර විට වැඩි Viral load එකක් ඇති සුනිල්ට වඩා අමරට මෙම වයිරස ආසාදනය නිසා අසාද්‍ය වීමට ඉඩ තිබෙනවා. වයිරසය නිසා අසාද්‍ය වීම රදා පවතින්නේ එක එක පුද්ගලයාගේ ශරීරයේ ප්‍රතිශක්තිකරන පද්ධතිය වයිරස ආසාදනය සදහා ප්‍රතිචාර දක්වන ආකාරය අනුවයි. මෙම PCR පරීක්ෂණය ඉතාමත් සංවේදී පරීක්ෂණයක් නිසා ඉතාමත් කුඩා ප්‍රමාණයක Viral RNA ඔබගේ ශරීරයේ තිබුනත් ඔබව වයිරස ආසාදිතයෙකු ලෙස ලේබල් වීමට පුලුවන්.
PCR පරීක්ෂණය 100% සාර්ථකද?
ඔව්. Annealing පියවරේදී එකතු කරනු ලබන primers විද්‍යාඥයින් විසින් ඉතාමත් සැලකිල්ලෙන් නිර්මාණය කරන ලද නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රම වේ. එම නිසා එම නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රම වලට ගැලපෙන අනුපූරක අනුක්‍රම RNA අණුවේ හමු නොවුනහොත් ඔවුන් ඒ සමග සම්බන්ද වන්නේ නැහැ. primers සම්බන්ද නොවන්නේ නම් RNA අණුවෙන් DNA අණුව සංශ්ලේෂණය ආරම්භ වන්නේ නැහැ. එම නිසා මෙම PCR පරීක්ෂණය කොරොනා ආසාදනය හදුනා ගැනීමට ඇති සාර්ථක ක්‍රමවේදයක් ලෙස සැලකෙනවා.
දිනෙන් දින වෙනස් වන SARS-CoV-2 වයිරසයේ විකෘති ප්‍රභේද මෙම PCR පරීක්ෂණය මගින් හදුනා ගත හැකිද?
වයිරසයේ RNA අනුක්‍රම දන්නා තාක් කල් PCR පරීක්ෂණ මගින් වයිරසයේ විකෘති ප්‍රභේද වුවද හදුනා ගැනීමට හැකියාව පවතිනවා. එම නිසා නව වයිරස ප්‍රභේදයක් සොයා ගත් වහාම පර්යේෂකයන් සිදු කල යුතු වන්නේ එම නව වයිරස ප්‍රභේදයේ RNA අනුක්‍රම එහෙමත් නැතිනම් නියුක්ලියෝටයිඩ පිහිටා ඇති පිළිවෙල හදුනා ගැනීමයි.
ඉතාමත් දීර්ඝ ලිපියක් වුනත් හැකි උපරිමයෙන් සරලව සියලු දේ විස්තර කිරීමට මා ගත් උත්සහය සාර්ථක යැයි විශ්වාස කරනවා. තවත් බොහෝමයක් තාක්ෂණික කරුණු මෙයට ඇතුලත් විය යුතු වුනත් වැදගත් දෑ පමණක් එක් කොට සියලු දෙනාට පැහැදිලි වන ලෙස මෙම ලිපිය ලියා අවසන් කිරීම මගේ බලාපොරොත්තුව වුන නිසා සමහර තාක්ෂණික කොටස් මා විසින් ලිපියට අන්තර්ගත කරනු ලැබුවේ නැහැ. අවසන් වන තෙක් කියවූ ඔබට තුති.
සටහන - Sameera Madushan
